編者按

中國(guó)農(nóng)科院質(zhì)標(biāo)所陳愛亮教授，研究方向主要為基于現(xiàn)代生物分析技術(shù)的食品質(zhì)量安全快速檢測(cè)、鑒別與溯源方法研究及產(chǎn)品研發(fā)等， 利用我司生產(chǎn)的微芯片實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀在食品安全領(lǐng)域進(jìn)行了大量科學(xué)研究，建立了一種基于芯片PCR的快速鑒別羊肉摻假成分的方法，其科研成果發(fā)表在《生物技術(shù)進(jìn)展》2018年的第6期，特此向陳老師表示致敬，以下為陳老師發(fā)表文章《羊肉摻假鑒別快速熒光定量 ＰＣＲ 芯片制備及應(yīng)用研究 》節(jié)選~~

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的提高，我國(guó)居民飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了重大的變化火鍋、羊肉串等備受喜愛。然而，目前羊肉制品摻假現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重。常見的摻假肉類主要包括豬肉、雞肉、鴨肉等有的甚至還會(huì)摻入鼠肉， 這種欺詐行為嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者權(quán)益，同時(shí)對(duì)社會(huì)發(fā)展帶來了消極影響。目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種肉品摻假檢測(cè)技術(shù)主要包括以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附、色譜質(zhì)譜技術(shù)以代謝物為基礎(chǔ)的紅外光譜技術(shù)和以核酸為基礎(chǔ)的ＰＣＲ檢測(cè)技術(shù)等，其中應(yīng)用多的為基于熒光定量ＰＣＲ的檢測(cè)技術(shù)但是現(xiàn)有技術(shù)所需時(shí)間較長(zhǎng)，無法滿足現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別的要求。同時(shí)，以羊肉串摻假為例，其摻假的肉類品種可能有豬肉、雞肉、鴨肉、甚至老鼠肉等。如果逐個(gè)對(duì)可能的摻假物種進(jìn)行ＰＣＲ檢測(cè)則存在操作繁瑣、分析時(shí)間長(zhǎng)等問題。 

近年來，芯片式快速熒光定量ＰＣＲ技術(shù)的發(fā)展為羊肉摻假鑒別等核酸檢測(cè)提供了一種快速多重的熒光定量ＰＣＲ檢測(cè)方法其是一種將芯片技術(shù)與熒光定量ＰＣＲ技術(shù)相結(jié)合的高新生物技術(shù)。傳統(tǒng)的微芯片技術(shù)是運(yùn)用微電機(jī)系統(tǒng)技術(shù)通過制作微管道等空間結(jié)構(gòu)及微加熱等控制結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)芯片上的快速ＰＣＲ擴(kuò)增而本研究通過將引物、反應(yīng)所需試劑預(yù)先凍干固定到芯片上只需將模板滴加至微孔內(nèi)即可進(jìn)行擴(kuò)增同時(shí)利用微芯片實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ儀實(shí)現(xiàn)通過熒光信號(hào)檢測(cè)ＰＣＲ產(chǎn)物該技術(shù)也可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)(植物病 原菌檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因鑒別)、畜牧(牛類病害鑒別、魚 類和家禽病原菌檢測(cè))、食品安全(病原菌鑒別、微生物腐*鑒別)、生命科學(xué)和醫(yī)療(人類疾病鑒別、人類基因檢測(cè))等領(lǐng)域。

為了建立一種基于芯片PCR的快速鑒別羊肉摻假成分的方法，將不同動(dòng)物源性成分的引物及反應(yīng)所需試劑預(yù)先凍干固定到空白芯片反應(yīng)池內(nèi)，以制備羊肉摻假鑒別快速熒光定量ＰＣＲ芯片，同時(shí)通過模擬摻假樣品(在羊肉中摻入豬肉、雞肉、鴨肉、鼠肉成分)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，對(duì)所得芯片的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。從與ＡＢＩ７５００熒光定量ＰＣＲ結(jié)果對(duì)比可知，基于芯片的快速熒光定量ＰＣＲ檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)５種動(dòng)物源性成分，具有較高的準(zhǔn)確性及可用性，且其ＰＣＲ擴(kuò)增時(shí)間較短，操作簡(jiǎn)單，滿足了羊肉摻假快速鑒別的要求，該芯片的研制及快速檢測(cè)方法的建立將有效的簡(jiǎn)化羊肉制品摻假檢測(cè)的步驟、縮短檢測(cè)時(shí)間，且成本較低，儀器便于攜帶，使現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)成為可能，研究結(jié)果為我國(guó)肉類食品安全監(jiān)管提供了有力保障。

１.１　 材料與試劑 

羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉均購(gòu)自北京市農(nóng)貿(mào)市 場(chǎng)?鼠肉由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所提供，二甲基亞砜、牛血清白蛋白、海藻糖等均購(gòu)自北京雁棲灣生物技術(shù)有限公司

１.２　 實(shí)驗(yàn)儀器 

７５００熒光定量 ＰＣＲ 儀(美國(guó) ＡＢＩ 公司)

ＡｒｉａＤＮＡ-１０便攜式微芯片實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ儀 (ＬＵＭＥＸ 分析儀器公司)等

１.３　 樣品制備 

用電子天平稱取羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、鼠肉各２０ｍｇ，用于提取引物特異性實(shí)驗(yàn)所用模板，再按照不同重量百分比(表１)分別稱取不同肌肉組織進(jìn)行混合作為模擬摻假樣品(每份樣品為２０ｍｇ)，總摻假比例為０~８０％。

１.４　 ＤＮＡ 的提取及檢測(cè) 

按照ＴＩＡＮａｍｐＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＫｉｔ說明書提取制備好的樣品的基因組ＤＮＡ，采用超微量分光 光度計(jì)對(duì)提取的ＤＮＡ進(jìn)行濃度及純度檢測(cè)? 其 濃度為１０~２０ｎｇ/μＬ，且純度較高(Ａ２６０/Ａ２８０為 １.８~１.９，Ａ２６０/Ａ２３０>２.０)，因此可用于后續(xù) ＰＣＲ 擴(kuò)增。

１.５　 引物特異性實(shí)驗(yàn)

研究所用引物均由北京生工生物技術(shù)有限公司合成，為了確定引物特異性 在ＡＢＩ７５００儀器上分別用羊源、豬源、雞源、鴨源與鼠源成分的特異性引物對(duì)５種肉的基因組 ＤＮＡ進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)體系(２０μＬ):２×ＰＣＲＭｉｘ １０μＬ１０ｍｏｌ/Ｌ正、反向引物各０.４μＬ，模板 ２ μＬ剩余用無菌去離子水補(bǔ)齊反應(yīng)程序:９５℃ ５ ｍｉｎ９５℃ ３ ｓ６０℃ ３２ ｓ共 ４０ 個(gè)循環(huán)；７２℃ ２ ｍｉｎ 添加熔解曲線。通過擴(kuò)增Ｃｔ 值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán) 數(shù))來判斷引物的特異性，Ｃｔ<３５為有效擴(kuò)增Ｃｔ ≥３５為無效擴(kuò)增。

１.６.１ 芯片的制備　 

本研究的空芯片微陣列設(shè)計(jì)為５×６陣列，每個(gè)位點(diǎn)包含凍干固定的一對(duì)引 物(表３)及反應(yīng)所需試劑。反應(yīng)體系(２０μＬ):２×ＰＣＲＭｉｘ１０μＬ１０ｍｏｌ/Ｌ正、反向引物各０.４ μＬ，剩余體積用無菌去離子水補(bǔ)齊，同時(shí)將５μＬ ０.５ｇ/ｍＬＤＭＳＯ、１.６５~１.９５ｍｇ保護(hù)劑ＢＳＡ、０.６~ １.２ｍｇ賦型劑海藻糖與２０μＬ反應(yīng)體系進(jìn)行混合，隨后?。?mu;Ｌ混合溶液滴加到芯片上，采用 凍干機(jī)進(jìn)行凍干(－４０℃冷凍 ２ ｈ)，置于４℃ 備用。

１.６.２　 芯片式ＰＣＲ反應(yīng)　 

將２μＬ模擬摻假樣品 １、２、３、４、５的基因組ＤＮＡ分別滴加到芯片的第 １、２、３、４、５列的反應(yīng)池內(nèi)，第６列為陰性對(duì)照，即不含任何模板。然后用６４０μＬ礦物油將液體覆蓋，以免高溫蒸發(fā)，此方法無需繁瑣的配制體系與 操作步驟，簡(jiǎn)單快速?，反應(yīng)程序:９５℃５ｍｉｎ，９５℃ ３ｓ?６０℃３２ｓ，?共４０個(gè)循環(huán)；７２℃ ２ｍｉｎ： 添加熔 解曲線。

２.１　 引物特異性實(shí)驗(yàn) 

引物的特異性是動(dòng)物源性成分核酸檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵，本研究利用篩選出的羊源、豬源、鴨源、雞 源與鼠源性成分的特異性引物對(duì)５種肉的基因組ＤＮＡ進(jìn)行擴(kuò)增。用羊源性引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，除了羊源ＤＮＡ出現(xiàn)擴(kuò)增且所對(duì)應(yīng)的 熔解曲線均為單峰外，其他物種模板均無擴(kuò)增且 熔解曲線為平滑的一條直線，說明羊源性引物的特異性較好； 豬源、雞源、鴨源與鼠源性引物與羊 的結(jié)果一致，表明５對(duì)引物特異性好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

２.２　 自制多重 ＰＣＲ芯片檢測(cè)模擬羊肉摻假樣品結(jié)果 

本研究利用自制的羊肉摻假鑒別多重 ＰＣＲ 芯片以及ＡｒｉａＤＮＡ-１０便攜式微芯片實(shí)時(shí)熒光定 量ＰＣＲ儀對(duì)５種模擬摻假樣品進(jìn)行檢測(cè)。各靶標(biāo)的擴(kuò)增Ｃｔ 值和擴(kuò)增曲線分表見下表和下圖。 

結(jié)合芯片式ＰＣＲ和ＡＢＩ７５００熒光定量ＰＣＲ 的結(jié)果可知：本研究所建立的擴(kuò)增體系中在ＡｒｉａＤＮＡ-１０儀器上用芯片進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)和ＡＢＩ７５００熒光定量ＰＣＲ檢測(cè)方法的結(jié)果高度一致，２種方法均能準(zhǔn)確的檢測(cè)出５種成分，且隨著動(dòng)物源性成分含量的減少相應(yīng)的Ｃｔ值會(huì)逐漸增加。要注意的是本研究無法通過Ｃｔ 值進(jìn)行定量檢測(cè)只能進(jìn)行定性檢測(cè)，即確定含有哪種成分的摻假。

根據(jù)５種模擬摻假樣品的成分配比可知，每個(gè)樣品中均含有羊源性成分。因此，采用羊源性引物對(duì)５種模擬摻假樣品進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，共５條擴(kuò)增曲線(圖２Ａ)。 同理。豬源、雞源、鴨源與鼠源性引物的位置分別出現(xiàn)４條、３條、２條與１條擴(kuò)增曲線，結(jié)果與已知樣品中所含成分保持一致。由于在實(shí)際應(yīng)用中若摻假比例太低，則獲利微薄。因此，本研究將低摻假比例設(shè)為２０％，未對(duì)含量更低的樣品進(jìn)行檢測(cè)，從圖２可以看出利用自制的ＰＣＲ芯片對(duì)５種模擬摻假樣品進(jìn)行檢測(cè)均可檢測(cè)到相應(yīng)的動(dòng)物源性成分，定性檢測(cè)準(zhǔn)確率 為１００％。同時(shí)，擴(kuò)增曲線表明自制的ＰＣＲ芯片具有較好的擴(kuò)增效率，而且隨著動(dòng)物源性成分含量的降低，相應(yīng)的Ｃｔ 值逐漸增大。

本研究建立了基于芯片的快速熒光定量ＰＣＲ檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的熒光定量ＰＣＲ相比，ＰＣＲ芯片一般由５×４或更多的反應(yīng)池組成可實(shí)現(xiàn)樣品多指標(biāo)的檢測(cè)。由于芯片式ＰＣＲ預(yù)先將反應(yīng)所需試劑和引物凍干保存只需將提取的ＤＮＡ模板滴加到芯片上即可進(jìn)行擴(kuò)增簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟、縮短了檢測(cè)時(shí)間。通過與ＡＢＩ７５００熒光定量ＰＣＲ結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)果具有一致性，均可準(zhǔn)確的檢測(cè)出５種成分且Ｃｔ值均隨著動(dòng)物源性成分比例的減少而升高。目前，已有很多關(guān)于利用ＰＣＲ技術(shù)檢測(cè)肉制品中摻假成分的報(bào)道Ｐｒｕｓａｋｏｖａ等采用多重ＰＣＲ擴(kuò)增法可同時(shí)鑒別肉類產(chǎn)品中５種常見的摻假肉類。每種肉類的檢測(cè)靈敏度可達(dá)３０ｐｇＤａｌｓｅｃｃｏ等采用熒光定量ＰＣＲ的方法可以檢測(cè)１０種不同的動(dòng)物源性成分?利用該方法對(duì)４６種實(shí)驗(yàn)肉品混合物進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示所有品種均鑒定正確檢測(cè)靈敏度為１％同時(shí)對(duì)１４種商業(yè)的肉類產(chǎn)品進(jìn)行分析結(jié)果表明１４個(gè)樣品中有６個(gè)含有雞肉原料，由此可知，該方法對(duì)肉類產(chǎn)品的分析是有效和可靠的，普通ＰＣＲ雖然操作簡(jiǎn)單、成本較低，但是對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)而傳統(tǒng)的熒光定量ＰＣＲ一般需要２ｈ才能完成，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本研究所建立的芯片式熒光定量ＰＣＲ擴(kuò)增法，由于所需樣本體積小(只需２μＬ)ＰＣＲ升降溫反應(yīng)速度快，可縮短至３０ｍｉｎ完成擴(kuò)增及數(shù)據(jù)收集，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短。該芯片的研制及快速檢測(cè)方法的建立將有效的簡(jiǎn)化羊肉制品摻假檢測(cè)的步驟、縮短檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)所用芯片檢測(cè)儀器Ｌｕｍｅｘ體積較小，攜帶方便為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。